In der Schlacht von Anghiari trat eine Mailänder Truppe gegen Truppen der italienischen Liga an. Die Armee der Italienischen Liga umfasste Streitkräfte der Republik Florenz mit Unterstützung päpstlicher Truppen. Es gab auch eine Gruppe von Rittern aus der Republik Venedig sowie Männer aus Anghiari. Am Ende des Tages war das Ergebnis der Schlacht ein Sieg für die florentinische Armee. Es bedeutete, dass die Kontrolle von Florenz über Mittelitalien gesichert war. Für die Einwohner von Florenz war die Schlacht von Anghiari ein wichtiger Sieg für sie. In den frühen 1500er Jahren, um ihren Sieg zu feiern, stellten sie Leonardo Da Vinci ein, um ein Wandbild der Schlacht von Anghiari zu malen. Das Wandbild war für den Salone dei Cinquecento (Saal der Fünfhundert) des Palazzo Vecchio in Florenz. Das Gemälde der Schlacht von Anghiari sollte eines der ehrgeizigsten Werke von Da Vinci werden. Es sollte ein groß angelegtes Werk mit einer Größe von 54 Fuß mal 21 Fuß werden. Das Ziel war es, drei Szenen zu haben, die den Beginn, die Mitte und das Ende des Kampfes zeigen.

Dank noch vorhandener Vorstudien von Leonardo Da Vinci ist viel über das Gemälde bekannt. Beispielsweise fertigte er im Rahmen seiner Recherchen für das Gemälde zwei Studien von schreienden Männern an. Von den drei Abschnitten ist der zentrale Schauplatz der Schlacht heute der bekannteste. Die Szene im Mittelstück des Bildes zeigt vier Reiter kollidierender Pferde und Kavallerie. Das Bild zeigt die Reiter, die in der Schlacht von Anghiari um die Kontrolle über die Standarte kämpfen. Was zu sehen ist, ist der florentinische Kommandant Pier Giampaolo Orsini, der gerade dabei ist, dem Mailänder Führer Niccolo Piccinino die Standarte abzureißen. Das Bild zeigt ein Gefühl von Macht und Emotionen zusammen mit einem Gefühl von Wut und Gewalt. Das zeigt sich nicht nur in den Gesichtern der Soldaten, sondern auch in den Pferden. Schriftsteller der damaligen Zeit kommentierten das Design von Da Vinci. Sie erwähnen seine Geschicklichkeit bei der Gestaltung der Uniformen der Soldaten sowie die kühnen Gesichtszüge der Pferde.

Dass wir so viel über das Herzstück wissen, liegt wahrscheinlich daran, dass es Kopien davon gibt. Eine dieser Kopien stammt von Peter Paul Rubens aus dem Jahr 1603. Obwohl es sich nicht um eine exakte Kopie handelt, zeigt die Zeichnung des Mittelteils, wie sie ausgesehen haben könnte. Rubens' Zeichnung hängt heute im Louvre in Paris. Da Vinci hat das Gemälde der Schlacht von Anghiari nicht vollendet. Er stellte die Arbeit an dem Gemälde 1505 ein, als er Florenz nach Mailand verließ. Obwohl aufgegeben, blieben die von ihm fertiggestellten Teile noch einige Jahre in der Halle. Bei der Arbeit an dem Kunstwerk entschied sich Da Vinci für eine Technik, die als Encaustic bekannt ist, was übersetzt „Fixieren durch Hitze“ bedeutet. Die Methode beinhaltet Heißwachsmalerei. Dazu muss Bienenwachs erhitzt und mit Farbpigmenten versetzt werden. Da die von ihm geplante Technik neu war, führte Da Vinci einen Probelauf durch. Er tat dies, indem er es auf ein Brett auftrug, das in einer warmen Umgebung gut trocknete.

In seinem Gemälde der Schlacht wollte Leonardo Da Vinci Ölfarben auf der Wand mit ihrer dicken Wachsgrundierung verwenden. Leider verlief die Arbeit an dem Gemälde nicht ohne Probleme. In der Nähe des Bildes stellte er große Kohlenbecken auf. Wahrscheinlich wegen der Größe des Gemäldes war Da Vinci nicht in der Lage, die Hitze der Kohlenbecken gleichmäßig darauf zu verteilen. Die Folge war eine Beschädigung des Gemäldes. Während er den unteren Teil der Arbeit retten konnte, vermischten sich die Farben oben. Da das Gemälde der Schlacht so groß war, entwickelte Da Vinci ein einzigartiges Design für das benötigte Gerüst. Das Design bedeutete, dass er es auf eine Weise anheben oder falten konnte, die seine Höhe oder Position veränderte. Indem er dies tun konnte, war es für ihn einfacher, den oberen Teil seines Kunstwerks fertigzustellen. Trotz aller Probleme, die Da Vinci hatte, war die Arbeit mehrere Jahre lang sichtbar.

Als solches konnten Maler wie Rubens es kopieren, und heute haben wir Beweise für die großartige Arbeit. Irgendwann zwischen 1555 und 1572 ging das Gemälde verloren, als Giorgio Vasari Arbeiten an der „Halle der Fünfhundert“ ausführte. Viele denken, dass das Bild in der Halle bleibt und Vasari es einfach überdeckt hat. Da Vincis Gemälde, das die Schlacht von Anghiari feiert, ist ein verschollenes Kunstwerk. Einige glauben, dass es noch unter einem der späteren Fresken im Saal der Fünfhundert im Palazzo Vecchio existiert. Trotz Umfragen wurden keine Beweise gefunden, die ein für alle Mal beweisen, dass das Gemälde existiert.